革兰氏染色原理和方法（常见细菌的革兰氏染色观察）

一、革兰氏染色液成分及原理

革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法。未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。

革兰氏阳性菌的细胞壁主要有90%的肽聚糖和10%的磷壁酸组成，几乎不含类脂质，厚度20-80nm。革兰氏阴性菌的细胞壁主要由肽聚糖、脂多糖构成，厚度约10-15nm。结晶紫初染和碘液媒染后，在菌体内形成了不溶于水的大分子复合物，在使用乙醇脱色时，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，失水网孔缩小，把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；革兰氏阴性菌其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。

二、操作步骤

1.涂片：在载玻片上滴少量纯化水，用接种环挑取少量菌苔涂开，自然干燥或微热干燥，再经火焰2-3次固定。

2.初染：加（结晶紫溶液）溶液A染1分钟，用清水冲去染液。

3.媒染：加（碘液）溶液B染1分钟，水洗。

4.脱色：加（95%乙醇）溶液C，不时摇动玻片约10-30秒，至无紫色脱落为止，水洗。

5.复染：加（沙黄复染液）溶液D，染1分钟，水洗。

6.观察：用滤纸吸水晾干后油镜镜检。阳性菌呈紫色、阴性菌呈红色。

三、注意事项

（1）涂片时挑取菌量不宜过多，涂片不宜过厚，否则可能导致染色不完全或脱色不完全。

（2）脱色是革兰氏染色操作中至关重要的一步，脱色时间要把握准确。脱色过度易导致革兰氏阳性菌染成红色，脱色不足易导致革兰氏阴性菌染成紫色。

（3）革兰氏染色宜选用细菌新鲜培养物。一些革兰氏阳性菌在培养时间过长后易出现老化现象，细胞壁发生改变，导致染色结果发生变化。

（4）并不是所有革兰氏阳性菌都会染成紫色，革兰氏阴性菌都会染成红色。一些细菌的细胞壁构成比较特殊或易发生改变，染色时会观察到相反的结果。

四、染色结果观察

（1）大肠埃希氏菌O157和普通大肠埃希氏菌、沙门氏菌为革兰氏阴菌，镜检形态为红色短杆菌。

（2）志贺氏菌为革兰氏阴性短杆菌

（3）产气荚膜梭菌为革兰氏阳性梭杆菌，有时可见菌体内膨大不着色的芽孢结构；单增李斯特氏菌为革兰氏阳性无芽孢短杆菌；蜡样芽胞杆菌为革兰氏阳性芽孢长杆菌，常呈链状排列，菌体内或外有时可见不着色的椭圆形芽孢。

（4）金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，常呈葡萄状堆积排列；副溶血性弧菌为革兰氏阴性杆菌，菌体略有弯曲呈弧状；唐菖蒲伯克霍尔德氏菌氏菌为革兰氏阴性杆菌。

（5）普通变形杆菌、奇异变形杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌为革兰氏阴性杆菌。